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新冠病毒（奥密克戎）RBD蛋白ELISA檢測試剂盒

【雙夹心酶聯(lian)免疫定量法】

產品货號：EKnCov-RBD-11

（實驗(yan)前請仔細(xi)阅讀產品說明书）

聲明：尊敬的客戶，感谢您選用本公司的產品。本試(shi)剂盒仅供體外研究使用、不用(yong)於臨床诊断(duan)!本試(shi)剂盒不含任郭(guo)具有生物危害成分，但是試剂(ji)盒使用涉及的檢測樣本請在具有相應生物安全防護等級實驗室(shi)進行，由此可能造成的所有生物安全危害(hai)由(you)使用者自行负責。

本產品適用於體外定量(liang)檢測人血清、血浆，細(xi)胞培养液或其它相(xiang)關生物液體中新冠病毒（SARS-Cov-2）（奥密克戎）RBD蛋白蛋白含量(liang)。使用前請(qing)仔細阅讀說明(ming)书並檢查試剂組分！如有疑(yi)問，請及時聯系我(wo)們，為方便行文，下(xia)文提到(dao)的RBD蛋白皆為SARS-Cov-2 B.1.1.529(Omicron)Spike RBD蛋白，所提(ti)到的(de)抗體也都為抗SARS-Cov-2 B.1.1.529(Omicron)Spike RBD抗體。

試剂盒組成：

組分名称	規格	保存条件	数量
ELISA酶標板(包被抗RBD蛋白抗體)	96T	-20℃	1
標準品(重組新冠病毒RBD蛋白)12.5ng/ml	0.5ml/支	-20℃	2
生物素標記抗新(xin)冠蛋白(bai)RBD抗體（100×）	120ul	-20℃	1
鏈霉親和素HRP（100×）	120ul	-20℃	1
通用稀释液	30ml	4℃	1
浓縮洗涤液（25×）	30ml	4℃	1
TMB底物液	12ml	4℃	1
反應終止液	12ml	4℃	1
酶標板覆膜			5
產品說明书			1

特別說明：

1.打開包裝后請及時檢(jian)查(cha)所有物品是否齊全完整。

2.一周内使用可存於4℃，需长時(shi)間保存或多次使用請按(an)保存条件存放。

檢測原理:

本試剂盒為雙抗體夹心法檢測抗原RBD蛋白，酶標板采用高親和力抗RBD蛋白抗體作為包被物，檢測時酶(mei)標板孔加入待檢樣品或標準品(pin)（哺乳(ru)動物重(zhong)組表達RBD蛋白），再加入生物素化抗RBD蛋白抗體,反(fan)應(ying)后加入鏈霉親和素HRP，最后加入單組份TMB底物液。 如果待檢樣品中含有RBD蛋白，TMB底物液在HRP催(cui)化下顯(xian)色，加(jia)入終止液終止顯(xian)色后，在(zai)酶標(biao)儀OD₄₅₀/OD₆₃₀讀(du)取吸光值(zhi)，吸光值大小與待(dai)檢測(ce)樣品中RBD蛋白(bai)浓度呈正相關，根據(ju)標準品浓度(du)/吸光值绘製的標準曲線，可計算出待(dai)檢樣品中RBD蛋白含量。

注意：結構活性不佳的RBD蛋白可能不容易被本試剂盒檢出，例如原核重組表達(da)的RBD蛋白可能(neng)无法被試剂(ji)盒檢出。

樣品收集:

1.血清：全血樣品於(yu)室温放置(zhi)2小時或4℃過夜后於1000×g离心20分(fen)鐘，取上清即(ji)可檢測，收集血液的試管應為一次性的无(wu)熱原，无内(nei)毒素試管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na₂，樣品采集后30分鐘内於1000×g离心15分(fen)鐘，取上清即(ji)可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.組織匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗組織，去除残(can)留(liu)血液（匀浆中裂解的紅細胞會影響測量結果），称重后將(jiang)組織(zhi)剪碎。將剪碎的組織與對應體积的PBS（一般按1:9的重量體积比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體(ti)积(ji)可根據實驗需要適当調整，並做(zuo)好記錄。推荐在PBS中加(jia)入蛋白酶抑(yi)製剂）加入玻璃匀(yun)浆器(qi)中，於冰上充分研(yan)磨(mo)。為了進一(yi)步裂解(jie)組織細胞，可以對匀浆(jiang)液進行超聲破碎(sui)，或反复冻融。最后將(jiang)匀浆液於(yu)5000×g离心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培养上清：取細胞培(pei)养上清於(yu)1000×g离心20分(fen)鐘，除去雜(za)質及(ji)細胞碎片。取上(shang)清檢測(ce)。

5.其它生物樣品：1000×g离心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品應清澈透明，悬浮物應离心去除。

7.樣品收集后若在1周内進行檢測的可保存(cun)於4℃，若不能及時檢測，請按(an)一次使用量分(fen)裝，冻存於-20℃(1個月内檢測)，或-80℃（6個月内檢測），避(bi)免反复冻(dong)融。

8.如(ru)果您的樣品中檢測物浓度高於標準品(pin)最高值，請根據實际情况(kuang)，做適(shi)当倍数稀释（建議先(xian)做预實驗，以確定稀释倍数）。

試驗所需自備物品:

1.酶標儀(450nm波长滤光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒温箱，雙蒸(zheng)水或去离子水(shui)

4.吸水紙

檢測前準備工作:

1.請提前20分鐘从(cong)冰箱中取出試剂(ji)盒，平衡(heng)至室温(wen)。

2.洗涤液配製：將浓縮(suo)洗涤(di)液用雙蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓縮洗涤液可(ke)能有結晶，屬於正常現象，可(ke)用40℃水浴微加熱使結晶完(wan)全溶解后再配製洗涤(di)液（加熱温(wen)度不(bu)要超過50℃，使用時洗(xi)涤液應為室温）。当日使用 。

3.標準品配製:浓度為12.5ng/mL 然后根據需要用通用稀释液 進行1：2倍比(bi)稀释(shi)（注：不要直接在反(fan)應孔中進行倍比(bi)稀释）。建(jian)議配製成以下(xia)浓度：12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0ng/mL，標準品&樣品稀释(shi)液直接作為空白孔0ng/mL

4.生物素標記抗RBD蛋白抗體工作液：實驗(yan)前計(ji)算当次實驗所需用量（以100μL/孔計），用通用稀释液稀释100倍，實际配製時應多配製100-200μL；

5.鏈霉親和素HRP工作液：實驗(yan)前計(ji)算当次實驗所需用量（以100μL/孔計），用通用稀释液稀释100倍 ，實际配製時應多配製100-200μL；

6.TMB底物液:使用前，提前(qian)放置室温平衡

洗涤方法:

1.自動洗板機：每孔(kong)加入洗涤液350μL，注入與吸出間隔60秒。

2.手工洗板：甩盡孔内液體，在洁净(jing)的吸水紙上(shang)拍干，每(mei)孔加洗(xi)涤液350μL，浸泡1-2分(fen)鐘，吸去（不可触及板(ban)壁(bi)）或甩掉酶(mei)標板内的液體，在厚的吸水紙(zhi)上拍干。

操作步骤:

實驗開始(shi)前，各試剂均應平衡至室温；試剂(ji)或樣品配製時，均需充分混匀，並(bing)盡量避免(mian)起泡。

1.加樣：分別設空白孔、標準品(pin)孔、待測樣(yang)品(pin)孔。空白孔加樣品稀释液100μL，標準(zhun)品孔分別加入依次梯度稀释(shi)標準品，待測樣品孔加待測(ce)樣品100μL，給酶標板覆膜，37℃孵育60分(fen)鐘。為(wei)保證(zheng)實驗結果有效性，每次實驗請使用新(xin)的標準(zhun)品溶液。

2.弃去(qu)孔内液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每(mei)孔，甩(shuai)干並(bing)在吸水紙上轻拍將孔内液體拍干。立(li)即每孔加入配好的生物素標記的抗RBD蛋白抗體工作液100μL（在使用前15 分鐘内配製），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加於酶標板底部，盡量不触及孔壁，轻轻晃動混匀。給酶標板覆膜，37℃孵育60分(fen)鐘。為(wei)保證(zheng)實驗結果有效性，每次實驗請使用新(xin)的標準(zhun)品溶液。

3.弃去(qu)孔内液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每(mei)孔，甩(shuai)干並(bing)在吸水紙上轻拍將孔内液體拍干；

4.立即每孔加入配好的鏈霉親和素HRP工作液100μL（在使用前15分鐘内配製），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加於酶標板底部，盡量不触及孔壁，轻轻晃動混匀。給酶標板覆膜，37℃孵育45分鐘;

5.弃去(qu)孔内液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每(mei)孔，甩(shuai)干並(bing)在吸水紙上轻拍將孔内液體拍干；

6.每孔加TMB底物溶液(TMB)100μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據實际顯**况酌情縮(suo)短或(huo)延长，但不可超(chao)過30分(fen)鐘。当標(biao)準孔出現明顯梯度時(shi)，即可終止(zhi)）。

7.每孔加終止液100μL，終止反應，此(ci)時藍(lan)色立轉李色。終止液的加(jia)入順(shun)序應盡量與底物液的加入順序相同。

8.立即用酶標儀在 450nm 波长測(ce)量各孔的光密度（OD值）。應提前打開酶標儀電(dian)源(yuan)，预(yu)熱儀器(qi)，設置好檢(jian)測程序。

9.實(shi)驗完毕后將(jiang)未用完的試剂按規定的保存温度放回冰箱保存至有效期結束。

注意事項：

1.保存：試剂盒中(zhong)各試剂請按說明书提示合(he)理存放。在储存及温育過程中避免將試剂暴(bao)露在強光(guang)中。所有試剂瓶(ping)盖须旋紧以防止蒸发(fa)和微生物的污染，否則(ze)可能會(hui)出現错误的結果。

2.酶標板：剛開启的酶標板孔中可(ke)能(neng)會有少黄水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果(guo)造成任郭(guo)影響。暂時不用的(de)板条應拆卸后放入備用铝箔(bo)袋，按推(tui)荐温度存放！

3.加樣：加樣或加試(shi)剂時(shi)，第一個孔與最后一個孔的加樣時間間(jian)隔如果太(tai)大，將會导致不(bu)同的“预温育”時間(jian)，从(cong)而明顯地影響到(dao)測量值的準確性及重复性。每次的加樣時間最好控製在10分鐘内。推荐設置复孔。

4.温育：為防止樣品蒸发，實(shi)驗時必须給酶(mei)標板覆膜；洗板(ban)后應盡快進行下步操作，避(bi)免酶標(biao)板處於干燥状態；嚴格遵(zun)守給定的温育時間和(he)温度。

5.洗涤：洗涤過程中反應孔中残(can)留的洗涤(di)液應在吸水紙上拍干，勿將(jiang)滤紙直接放入反(fan)應孔中吸水。在讀数前要注(zhu)意清除底部残留的液體和手指(zhi)印，以免影響酶標儀讀(du)数。

6.顯色時(shi)間的控製：加入底(di)物后請定時觀察反應孔(kong)的顏色變化（比如每隔5分(fen)鐘），如梯度已很明(ming)顯，請提前加入終止液終止反應，避免顏(yan)色過深影響酶標(biao)儀讀数。

7.底物：底物請避光保存，在储存和温育時避免強光直接照(zhao)射(she)。

8.混匀：充分(fen)轻微混匀對反應結果尤為重要，最好使用微量振荡器(使用最低頻率)，如无(wu)微量振(zhen)荡器，可在(zai)反應前手工轻轻敲擊酶標板(ban)框混匀。

9.安全：試驗中請穿着實驗(yan)服並带乳胶手套做好防護工作。特別是(shi)檢測血液或者其他體液樣品時，請按國家(jia)生物(wu)試驗室安全防護条例執行。

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