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新冠病毒(du)RBD蛋白ELISA檢測試剂盒

【雙夹心酶(mei)聯免疫定量法(fa)】

產品货號：EKnCov-RBD-01

（實驗前請仔細阅讀產品說明书(shu)）

聲明：尊敬的客戶，感谢您選用本公司的產品。本試(shi)剂盒仅供體外(wai)研究使用、不用於臨床诊断!本(ben)試剂盒不含任郭具有生物危害成(cheng)分，但是試剂盒使用涉及的檢測樣本請在具有相(xiang)應生物安全防護等級實驗室進(jin)行，由此可(ke)能造成的所有生物安全危害由(you)使用者自行负責。

本產品適用於體外定量檢測人血清(qing)、血浆，細胞培养液或(huo)其它相關生物液體中新冠病毒(du)（SARS-Cov-2）N蛋白含量(liang)。使用前請仔(zai)細阅讀說明书並檢查試(shi)剂組分！如(ru)有疑問，請及時聯系我們。

 

試剂盒組成：

組分名称	規格	保存条件	数量
ELISA酶標板(包被抗(kang)RBD蛋白抗體)	96T	-20℃	1
標準品(重組新冠病毒RBD蛋白)	0.5ml/支	-20℃	2
生物素標記抗新冠蛋白RBD抗體(ti)（100×）	120ul	-20℃	1
鏈霉親和素HRP（100×）	120ul	-20℃	1
通用稀释液	30ml	4℃	1
浓縮洗涤液（25×）	30ml	4℃	1
TMB底物液	12ml	4℃	1
反應終止液	12ml	4℃	1
酶標板覆膜			5
產品說明书			1

 

特別說明：

1.打開包裝后請及時檢(jian)查所有物品是否齊全完整(zheng)。

2.一周内(nei)使用可存(cun)於4℃，需长時間保存或多次使用請按保存条件存放。

 

檢測原理:

本試剂盒為雙抗體夹心(xin)法檢(jian)測抗原RBD蛋白，酶標板采用(yong)高(gao)親和力抗RBD蛋白(bai)抗體作為包被(bei)物，檢測時酶標板孔加入(ru)待檢樣品(pin)或標準品（哺乳動物重組表達RBD蛋白），再(zai)加入生物素化抗RBD蛋白抗體,反應后加(jia)入鏈霉親和素HRP，最后加入(ru)單組份(fen)TMB底物液。 如果待檢樣品中(zhong)含有RBD蛋白，TMB底物液在HRP催化下顯色，加(jia)入終止液終止顯(xian)色后，在酶標儀OD450/OD630讀(du)取吸光值(zhi)，吸光值大小與待檢測樣(yang)品(pin)中RBD蛋(dan)白浓度呈正相關(guan)，根據標準品浓(nong)度/吸光值绘製的(de)標準曲線，可計算出(chu)待檢樣品中RBD蛋白含量。

注意：結構活性不佳的RBD蛋白可能不容易被本試剂(ji)盒檢出，例如原核重組(zu)表達的(de)RBD蛋白可能(neng)无法被試剂(ji)盒檢出。

樣品收集:

1.血清：全血(xue)樣品於室温放置(zhi)2小時或(huo)4℃過夜后(hou)於1000×g离心20分鐘，取上(shang)清(qing)即可檢測，收(shou)集血液的試管應為一次性(xing)的无熱原，无内毒素試(shi)管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，樣品采集后30分(fen)鐘内於1000×g离心15分鐘，取上(shang)清(qing)即可檢測。避免使用溶(rong)血(xue)，高血脂樣品。

3.組織匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗組(zu)織，去除残留血液（匀浆中裂解的紅細胞會影(ying)響測(ce)量結果），称(cheng)重后將(jiang)組織剪碎。將剪碎的組織與(yu)對應體(ti)积的PBS（一般(ban)按1:9的(de)重量體(ti)积比，比如1g的(de)組織樣品對應9mL的PBS，具體體积可根據實(shi)驗需(xu)要適当調整，並做好記錄。推荐(jian)在PBS中加(jia)入蛋白酶抑(yi)製剂）加入玻璃匀浆器中，於冰(bing)上充分研磨。為了(le)進一步裂解組織細胞，可以對匀(yun)浆液進行超(chao)聲破碎，或反复冻融。最后(hou)將匀(yun)浆液於5000×g离心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培养上清：取細胞培(pei)养上清於(yu)1000×g离心20分鐘，除去雜質(zhi)及細胞碎(sui)片。取上清檢測。

5.其它生物樣品：1000×g离心20分鐘，取上(shang)清(qing)即可檢測。

6.樣品應清澈透明，悬浮物應离心去除(chu)。

7.樣品收集后若在1周内進行檢(jian)測的(de)可保存於4℃，若(ruo)不能及時檢測，請按一次使用量分裝，冻存於-20℃(1個月内檢測)，或-80℃（6個月内檢測），避免反复冻(dong)融。

8.如果您的樣品中檢測物浓(nong)度(du)高於標準品最高值，請根據實际情(qing)况，做適当倍数稀(xi)释（建議先(xian)做预實驗，以確定稀(xi)释倍数）。

 

試驗所需自備物品:

1.酶標儀(450nm波长滤光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸(xi)头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒温箱(xiang)，雙蒸水或去(qu)离子水(shui)

4.吸水紙

 

檢測前準備工作:

1.請提前20分鐘从(cong)冰箱中取出試(shi)剂盒，平衡至室温。

2.洗涤液配製：將浓縮洗涤液用雙蒸水稀释(1:25)。未用完的放回(hui)4℃。从冰箱中取出的浓縮洗涤液可能有結晶，屬於正常現象，可用40℃水浴微加熱使結(jie)晶完全溶解后再(zai)配製洗涤液（加熱温度不要(yao)超過(guo)50℃，使用時洗涤液應為室温）。当日使用 。

3.標準品配製:根據需要用通用稀释液 進行1：2倍比稀释（注：不要直接(jie)在反應孔(kong)中進行倍比稀释）。

4.生物(wu)素標記抗RBD蛋白抗體工作液：實驗前計算当次實驗(yan)所需用量(liang)（以100μL/孔計），用通用稀释液稀释100倍，實际配製時應多配製100-200μL；

 

5.鏈霉親和素HRP工作液：實驗前計算当次實驗(yan)所需用量(liang)（以100μL/孔計），用通用稀释液稀释100倍 ，實际配製時應多配製100-200μL；

6.TMB底物液:使用前，提前放置(zhi)室温平衡

 

洗涤方法:

1.自動洗板機：每孔加入洗涤液350μL，注入與(yu)吸出間隔60秒。

2.手工洗板：甩盡孔内液體，在洁净的吸水紙上拍(pai)干，每孔加(jia)洗涤液350μL，浸泡1-2分鐘，吸去（不可触(chu)及板壁(bi)）或甩掉酶標板内的液(ye)體(ti)，在厚的吸水紙(zhi)上拍干。

 

操作步骤:

實驗(yan)開始前，各試剂均應平衡至(zhi)室(shi)温；試剂或樣(yang)品(pin)配製時，均需(xu)充分混匀，並盡量避免起泡。

1.加樣：分別設(she)空白孔、標準品孔、待測樣品(pin)孔。空白孔加樣品稀释液100μL，標準(zhun)品孔分別加入依次梯度稀释標準(zhun)品，待測樣品孔加待測樣(yang)品(pin)100μL，給酶標板覆(fu)膜，37℃孵育60分鐘。為保(bao)證實驗結果(guo)有效性，每次實驗請使(shi)用新的標(biao)準品溶液。

2.弃去(qu)孔内液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩(shuai)干並在(zai)吸水紙上轻拍將孔内液體拍干。立即每孔加入配好的生物素標記的抗RBD蛋白抗體工作液100μL（在使用前(qian)15 分鐘内配製(zhi)），注(zhu)意不要有(you)氣泡，加樣時將樣品加(jia)於酶標板底(di)部，盡量不触及孔壁，轻轻晃動混匀(yun)。給酶標板覆(fu)膜，37℃孵育60分鐘。為保(bao)證實驗結果(guo)有效性，每次實驗請使(shi)用新的標(biao)準品溶液。

3.弃去(qu)孔内液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩(shuai)干並在(zai)吸水紙上轻拍將孔内液體拍干；

4.立即每孔加入配好的鏈霉親和素HRP工作液100μL（在使用前(qian)15分鐘内配製(zhi)），注(zhu)意不要有(you)氣泡，加樣時將樣品加(jia)於酶標板底(di)部，盡量不触及孔壁，轻轻晃動混匀(yun)。給酶標板覆(fu)膜，37℃孵育45分鐘;

5.弃去(qu)孔内液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩(shuai)干並在(zai)吸水紙上轻拍將孔内液體拍干；

6.每孔(kong)加TMB底(di)物溶液(TMB)100μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右(you)（根(gen)據實际顯**况酌情縮短(duan)或延长，但不(bu)可(ke)超過30分鐘。当標準孔出現明顯梯度(du)時，即可終止）。

7.每孔加終止(zhi)液(ye)100μL，終止反應，此(ci)時藍色立轉李色(se)。終止液的加(jia)入順(shun)序應盡量與底物液的加入順序相同。

8.立即用酶標儀在(zai) 450nm 波(bo)长測量各孔的光密度（OD值）。應提前打開酶(mei)標儀電源，预(yu)熱儀器，設置好檢測程序(xu)。

9.實驗完毕后將未用完的試(shi)剂按規定的保存温度放回冰箱保(bao)存至有效期結束。

 

注意事項：

1.保存：試剂盒中各試剂請按說明书提示合理存放。在(zai)储存及温育過程中避免將試剂暴露在強光(guang)中。所有試剂瓶盖须旋紧以(yi)防止蒸发和微生物的污染，否則可能會出現错误(wu)的(de)結果。

2.酶標板：剛開启的(de)酶標板孔中可能會有少黄水樣物質，此為(wei)正(zheng)常現象，不(bu)會對實驗結果造成任郭(guo)影響。暂時不用的板条應(ying)拆卸后放入備(bei)用铝箔袋，按推荐(jian)温(wen)度存放！

3.加樣：加(jia)樣或加試剂時，第一個孔與最后一個孔的加(jia)樣時間間隔如果太大，將會导致不(bu)同(tong)的“预(yu)温育”時間，从而明顯地影響到測量值的準確性及重复性(xing)。每次的加樣(yang)時間最好控製在10分鐘内。推荐設(she)置复孔。

4.温育：為防止樣品蒸发，實驗時必须給(gei)酶標板覆膜(mo)；洗板后(hou)應(ying)盡快進行下步操作，避免酶標板處於干燥(zao)状態；嚴格遵守給定的温育時間和温度。

5.洗涤：洗涤(di)過程中反應孔中残留的洗涤液應在(zai)吸水紙上拍干，勿將滤紙直接放入反應孔中(zhong)吸(xi)水。在讀数前要注(zhu)意清除底部残留的液體和手指(zhi)印，以免影(ying)響酶(mei)標儀讀数。