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免疫組化

免疫組化染色實驗原理及步骤

實驗原理  抗體和抗原之間的(de)結合具有高度的特异(yi)性，正是利用了这(zhe)一原理。先(xian)將組織或細胞中的某種化學物(wu)質提取出來，以此作為抗原(yuan)或，通(tong)過免疫動物后(hou)获得特异性的抗體，再以此抗體去探測組織或(huo)細胞中(zhong)的同類的抗原物質。由於抗原與(yu)抗體的复(fu)合物是无色的，因此還必须借助於組織化學的方法將抗原(yuan)抗體結合的部位顯示(shi)出來，以其(qi)達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或(huo)定量的研究。

免疫組化染色實驗步骤

石蜡切片的脱蜡至(zhi)水處理流程需要依次將切片(pian)經历多個溶剂浸泡步骤：首先在二甲(jia)苯Ⅰ中浸泡20分鐘(zhong)進行初步脱蜡(la)，随后轉移至二甲苯Ⅱ中繼續浸泡20分鐘以(yi)確保蜡質完全溶解，接(jie)着依(yi)次通過无水乙醇Ⅰ浸泡(pao)5分鐘和无水乙醇Ⅱ浸泡(pao)5分鐘

2. 抗原修复：組織(zhi)切片置於盛(sheng)满柠檬酸（PH6.0)抗原修复液的高壓锅内進(jin)行抗原修(xiu)复，喷氣計時(shi)2.5min， 自然冷卻后將玻片置於 PBS（PH7.4）中在(zai)脱色摇床上晃動洗涤 3 次，每次 5min；

3. 阻断内源性過氧化物酶：切片放入0.3%甲醇過氧化氢(qing)溶液，室(shi)温避光孵育 20 min，將玻片(pian)置於 PBS（PH7.4）中在(zai)脱色摇床上晃動洗涤 3 次，每次 5min；

在組織切片製備(bei)的免疫組化流程中(zhong)，於切片甩干(gan)后需采用組化筆在組織(zhi)周围画圈以防止抗體液體流失，随后(hou)在圈(quan)内滴加5%BSA溶液進行血清封(feng)闭處理，在室温条件下(xia)封闭1h，以(yi)有效阻断(duan)非特异性

5. 加一抗：轻轻(qing)甩掉(diao)封闭液，在切片上滴加按一定比例(li)配好的(de)一抗，切片平放於湿(shi)盒内 4°C 孵育過夜（湿盒内加少量水防止抗體(ti)蒸发）；

6.  加生物素二抗：玻片置(zhi)於 PBS（PH7.4）中在(zai)脱色摇床上晃動洗涤 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈内滴加生物素偶(ou)聯的二抗，覆盖組織，室温孵育 50min；

7. 鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶孵育步(bu)骤：首先將玻片置於 PBS（PH7.4）缓冲液中，在脱色摇床上晃動洗涤(di) 3 次，每次 8 分鐘，確保残留物充分清洗(xi)。切片稍甩干后在組(zu)織圈内滴加(jia)鏈霉菌抗生素蛋白-過氧(yang)化物酶溶液，使其均匀覆盖組(zu)織表面，置於室温(wen)条件(jian)下孵育 50 分鐘，使酶與抗原充分結合(he)。孵育完成后再次將玻(bo)片(pian)置於 PBS（PH7.4）缓冲液中，在脱色摇床上晃動洗涤(di) 3 次，每次 8 分鐘，去除未結合的酶复合(he)物。

8.  DAB 顯色：玻片置(zhi)於 PBS（PH7.4）中在(zai)脱色摇床上晃動洗涤 3 次，每次 5min；切片稍甩(shuai)干后在圈内滴加新鮮配(pei)製的 DAB 顯色液(ye)，顯微镜下控製顯(xian)色時間(jian)，阳性為棕李色， 自來(lai)水冲洗切片終止顯色；

复(fu)染細胞核時(shi)，采用Harris苏木素進行(xing)复染，保持時間約3分鐘左右(you)，随后使用自來水進行清洗(xi)，再通過分化液(ye)進行数秒鐘的(de)分化處理，最后用自來水充分(fen)冲洗，借助流(liu)水返(fan)

組織切片的脱水與封片是病理製(zhi)片的關键后處(chu)理環節，需要通過分阶段浸液(ye)實現組織内水(shui)分的逐步置换與透明化。具體操作流程(cheng)為(wei)：將製備好的(de)切片依次置入(ru)75%酒精中浸泡6分鐘、85%酒精中浸泡6分鐘、无水乙醇Ⅰ中浸泡6分鐘、无水乙醇Ⅱ中浸泡6分鐘、二甲苯Ⅰ中浸泡7分鐘、二甲苯Ⅱ中浸泡7分鐘，以(yi)完成脱水透明的(de)全過程。

11.  顯微镜镜檢(jian)，圖像(xiang)采集分(fen)析。

三、染色結果判讀：苏木素染細胞核為藍色，DAB 顯出(chu)的阳性表達為棕(zong)李色。

免疫荧光

免疫荧光(guang)染色實驗原理及步骤

實驗原理   免疫學的基(ji)本反應是(shi)抗原-抗體反應。由於(yu)具有高度的特异性，所(suo)以当抗原抗(kang)體发生反應時，只(zhi)要知道其中的一個因素，就可以查出(chu)另一個因素。免疫荧光技術就是將不影響抗原抗體(ti)活性的荧光色素標記在抗體(ti)（或抗原(yuan)）上，與其相應的抗原（或抗體(ti)）結合(he)后，在下呈現一種特异性荧光反(fan)應(ying)。

免疫荧光染色實驗步骤

1. 石蜡(la)切片脱蜡至水：依次將切片放入(ru)二(er)甲苯Ⅰ8min-二甲苯Ⅱ8min-无水乙醇Ⅰ 6min-无水乙醇Ⅱ 6min-95%酒精  6min-85%酒精 6min-75%酒精  5min-流(liu)水冲洗(xi)；

在病理诊断和(he)免疫組化檢測的工(gong)作流程中，抗原修复作為關键(jian)的前(qian)處理環節，直接(jie)影響后(hou)續的檢測灵敏度和特异性。組織切(qie)片置於盛(sheng)有柠檬酸（PH6.0）抗原修复液的高壓锅内進(jin)行抗原修(xiu)复，通過加熱使掩蔽的抗原位點暴露，喷氣計時(shi)2.5分鐘以達到(dao)標準的(de)修复条件。

3. 滅活：0.3%甲醇過氧化氢(qing)滅活15min，PBS（PH7.4）中在(zai)脱色摇床上晃動洗涤 3 次，每次 6min；

在切片經(jing)過甩(shuai)干處理之后，需要使用組化筆在組織周围画圈以防止后續加入的抗體溶液流散，随后在圈内滴加浓度為5%的BSA溶(rong)液進行封闭，此步骤在室温条件下進行(xing)，封闭時間設定為1小時，以

加一抗：轻轻(qing)甩掉(diao)封闭液，在切片上滴加按一定比例(li)配好的(de)一抗，切片平放於湿盒内進行4°C孵育過夜，此過程中需在湿盒内加入少量水以防止抗體因環境干燥而发生蒸发，確保抗體與組織(zhi)切片充分接(jie)触反應。

加二抗：玻片置(zhi)於PBS（PH7.4）缓冲液中放置於脱(tuo)色摇床上晃(huang)動洗涤3次，每次8min，確保一抗充分漂洗。切(qie)片(pian)經轻轻甩干后，在組織周围圈内精準滴加與實驗動物種屬相對(dui)應的荧光二抗溶(rong)液，使其均匀覆盖組(zu)織表面。随后(hou)將玻片置於室温環(huan)境下進行孵育，孵育時間為120min，使荧光(guang)二抗與一抗充分結合。

7.  DAPI染核：滴加(jia) DAPI，室温孵育10min，之后玻(bo)片(pian)置於 PBS（PH7.4）中在(zai)脱色摇床上晃動洗涤 3 次，每次 6min；

8. 封片：抗荧光淬滅剂封片；

9. 镜檢拍照：切片(pian)於荧光顯微镜下(xia)觀察並采集圖像。（DAPI紫外激发(fa)波长330-380nm，发射波长420nm，发藍光；FITC激发(fa)波长(zhang)465-495nm，发射波长515-555 nm，发(fa)綠光；CY3激发(fa)波长(zhang)510-560，发射波长590nm，发紅光）。

染色結果判讀涉及多個荧光(guang)通道的同步觀察與分析：其中DAPI染料對細胞核的標記在紫外光激发下呈現藍色荧光信號，而目的基因或蛋(dan)白質的阳性表達則通過(guo)

多重免疫荧光

多重荧光(guang)染色實驗原理及步骤

實驗原理與(yu)技術基礎 酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術是一(yi)類利用辣(la)根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法。该技術在免疫(yi)組織化學檢測领域(yu)的應用原理與常規免疫組化的DAB顯色方法相似(shi)，均以HRP作為關键酶學試剂驅(qu)動反應過(guo)程。TSA技術同(tong)樣采(cai)用HRP標記的二抗作為檢測(ce)單元，並具有對應(ying)的"顯色"步骤，其核心機(ji)製在於HRP催(cui)化反應體系(xi)中加入的酪胺荧光素底物，經HRP催化后生成活化荧光底物(wu)。这些活化底物分子(zi)具有高(gao)度的化學反應性，可與抗原分子(zi)上的酪氨酸等含酚羟基的残基形(xing)成稳定的共价結合，使樣(yang)品表面沉积並保留稳定的共价結合(he)酪胺荧光素分子。檢(jian)測周期中，研究人(ren)員通過熱修复法或抗體(ti)洗脱液洗去未結合的一抗-二抗-HRP复合物(wu)，随(sui)后進行下一轮孵育(yu)，换用另一種一抗與對(dui)應的(de)HRP二抗，同(tong)時采用不同光谱特性的酪(lao)胺荧光素底物進行反應。

免疫荧光染色實驗步骤：

复温(wen)，水洗：將冷藏保存於(yu)-20℃環境下(xia)的切片樣品取出后，需要在室(shi)温条件下(xia)進行复温處理，整個复(fu)温阶段耗時30min，之后使(shi)

固定步骤：將(jiang)已切片的樣品浸入4%的多聚甲醛溶液中(zhong)進行固定處(chu)理，固定時間為15分鐘，随后(hou)用(yong)磷酸盐缓冲液（PBS）進行漂洗，

3. 通透：滴加(jia)0.3%Triton-X100破膜液通透20min，用PBS洗3次，每次5min；

4. 阻断内源性過(guo)氧化氢酶：切片入3%過氧化氢(qing)溶液，室(shi)温避光孵育15min，用PBS洗3次，每次5min；

封闭：在切片經過適度甩干(gan)處理后(hou)，使用組化(hua)筆在組織周围画圈以防止后續加入的抗(kang)體流失，随后(hou)在圈(quan)内滴加5%BSA溶液(ye)，於室温条件下進(jin)行1h的封闭操作。

加一抗：轻轻(qing)甩掉(diao)封闭液，在切片上均匀滴加按照特定比例配製好的一(yi)抗液(ye)，随后將切片平(ping)放於湿盒内進行4℃低温孵(fu)育(yu)，整個(ge)孵育過程持續過夜，期間需(xu)在湿盒内加入少量蒸馏水以防止抗體液发生蒸(zheng)发

7. 复温：湿盒从4℃拿出來(lai)复温1h，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

將已進行前期(qi)免疫(yi)標記的組織切片在甩干后，在規定的圈内滴加與所用實驗動物種屬相對應的HRP二級抗體溶液，確保抗體液體完全覆盖組織切片表面，随后在室温条(tiao)件下避光孵育50分鐘，使抗(kang)體充分與一級抗體(ti)結合。

在免(mian)疫荧光檢測(ce)流程中，TSA荧光染料(liao)反應(ying)液反應FITC（TYR-488）是信號放(fang)大的關键步骤(zhou)。具體操作為：將TSA荧光染料反應液均(jun)匀滴加至切片表面，確保組織樣本充分覆盖，於室温条件下反(fan)應(ying)10min，使荧光基團與(yu)抗原位點結合。

10. 抗體洗脱：將切片置於抗體洗脱液中洗脱15min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

11. 加第二種一抗：轻轻(qing)甩掉(diao)封闭液，在切片上滴加按一定比例(li)配好的(de)一抗，切片平放於湿(shi)盒内4℃孵育過夜（湿盒内加少量水防止抗體(ti)蒸发）；

12. 复温：湿盒从4℃拿出來(lai)复温1h，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

13. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈内滴加(jia)與種屬對(dui)應的HRP二抗，覆盖組織，室(shi)温避光孵育50min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

14. TSA荧光染料反應液反應cy3（TYR-555）：切片滴(di)加TSA荧光染料反應(ying)液均匀覆盖組織反(fan)應10min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

15. 抗體洗脱：將切片置於抗體洗脱液中洗脱15min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min

16. 加第三種一抗：轻轻(qing)甩掉(diao)封闭液，在切片上滴加按一定比例(li)配好的(de)一抗，切片平放於湿(shi)盒内4℃孵育過夜（湿盒内加少量水防止抗體(ti)蒸发）；

17. 复温：湿盒从4℃拿出來(lai)复温1h，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

18. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈内滴加(jia)與種屬對(dui)應的HRP二抗，覆盖組織，室(shi)温避光孵育50min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

19. TSA荧光染料反應液反應594（TYR-594）：切片滴(di)加TSA荧光染料反應(ying)液均匀覆盖組織反(fan)應10min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

20. 抗體洗脱：將切片置於抗體洗脱液中洗脱15min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min

21. 加第四種一抗：轻轻(qing)甩掉(diao)封闭液，在切片上滴加按一定比例(li)配好的(de)一抗，切片平放於湿(shi)盒内4℃孵育過夜（湿盒内加少量水防止抗體(ti)蒸发）；

22. 复温：湿盒从4℃拿出來(lai)复温1h，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

23. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈内滴加(jia)與種屬對(dui)應的HRP二抗，覆盖組織，室(shi)温避光孵育50min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

24. TSA荧光染料反應液反應cy5（TYR-647）：切片滴(di)加TSA荧光染料反應(ying)液均匀覆盖組織反(fan)應10min，將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；

25. DAPI染核：將玻片(pian)置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次8min；滴加(jia)DAPI,室(shi)温避光孵育10min，之后將玻片置於PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃動洗涤(di)3次，每次6min；

26. 封片：抗荧光淬滅剂封片；

27. 镜檢拍照：切片(pian)於荧光顯微镜下(xia)觀察並采集圖像，（DAPI紫外激发(fa)波长330-380nm，发射波长420nm，发藍光；FITC激发(fa)波长(zhang)465-495nm，发射波长515-555 nm，发(fa)綠光；CY3激发(fa)波长(zhang)510-560，发射波长590nm，发紅光. 647荧光激发波长 608-648nm, 发射波长672-712,，原本為正紅色，為了與CY3區分開，我們設定為粉色(se)光。 594激发(fa)波长(zhang)594nm，发射波长615nm. 我(wo)們設定為紫紅色。）。